用于细胞培养的聚丙烯酰胺水凝胶的制备

用于细胞培养的聚丙烯酰胺水凝胶的制备  简介（INTRODUCTION） 细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）不仅为细胞提供结构支持，还通过其生化与生物物理特性调控细胞行为。其中，基质的弹性模量（elastic modulus, E），通常称为“硬度”（stiffness），是影响贴壁依赖性细胞功能的重要参数。不同组织的弹性模量差异显著：例如脑组织的硬度约为0.1–1 kPa，肌肉组织为8–17 kPa，而骨组织可达25–40 kPa。研究表明，基质硬度可显著影响细胞的增殖、迁移、铺展、形态、分化等多种行为，甚至决定干细胞的命运。 为在体外模拟体内不同组织的力学微环境，研究人员常使用聚丙烯酰胺（Polyacrylamide, PA）水凝胶作为可调硬度的细胞培养基底。PA水凝胶具有多项优势：其弹性可通过调节丙烯酰胺（acrylamide）与交联剂双丙烯酰胺（bis-acrylamide）的比例精确控制；其表面化学性质在不同硬度条件下保持一致，有利于排除化学信号干扰；其非吸附性可减少非特异性蛋白结合，仅通过共价偶联的方式引入特定ECM蛋白，实现细胞特异性黏附。 本实验技术标准化流程旨在提供一套可复制、可调控的实验方法，用于制备具有恒定或梯度力学性能的PA水凝胶基底，并通过共价修饰ECM蛋白，构建适用于细胞力学感应研究的体外模型。该流程包括两部分核心内容：（1）制备恒定硬度的静态柔顺水凝胶；（2）通过光交联剂sulfo-SANPAH将ECM蛋白共价偶联至水凝胶表面。通过该流程，研究者可根据目标细胞类型及实验需求，灵活调整凝胶硬度与蛋白配体类型，从而模拟体内不同组织的力学微环境，开展细胞-基质相互作用研究。  材料（MATERIALS） 试剂（REAGENTS） 试剂 厂家 货号 Acrylamide (40% w/v stock) 阿拉丁 Bis-acrylamide (2% w/v stock) 阿拉丁 Ammonium persulfate (APS, 10% w/v) 阿拉丁 Tetramethylethylenediamine (TEMED) 阿拉丁 Glutaraldehyde (0.5% v/v in PBS) 阿拉丁 Sulfo-SANPAH 阿拉丁 HEPES buffer (50 mM, pH 8.5) 阿拉丁

 器械（EQUIPMENT） 20W 365 nm LED光源。

 实验步骤（PROCEDURE） 在制备聚丙烯酰胺水凝胶时，常常会将上下两块玻片分别氨基化和甲基化，甲基化的玻片呈现疏水作用，当聚丙酰胺聚合好之后容易从甲基化的玻璃片上脱离。而氨基化的玻片则相对黏附更加牢固，一说是因为发生了迈克尔加成反应所致，另一种方案则直接在凝胶中加入了NHS进行交联使水凝胶直接共价结合在玻片上。但是实际上在丙烯酰胺聚合过程中：丙烯酰胺的 C=C 双键被自由基聚合消耗；若玻片表面有亲核性基团（如 –NH₂ 或 –SH），理论上可能对未反应的单体发生 迈克尔加成。但是——聚合反应速率极快（APS/TEMED激发自由基几乎瞬间消耗大部分丙烯酰胺双键）；表面 –CHO 基团在水溶液中主要与 –NH₂ 形成 席夫碱 (–C=N–) 或进一步还原形成 –CH₂–NH– 键；玻片表面此时基本不含能有效参与迈克尔加成的活泼亲核位点（醛基不是强亲核体）； 因此，不太可能发生显著的迈克尔加成。 另一种可能的方案是使用 3-(methacryloyloxy)propyl trimethoxysilane (MPS，俗称 methacrylate-silane / Bind‑Silane) 对玻片进行丙烯酰基化处理，使玻片在丙烯酰胺自由基原位聚合过程中通过共聚入网状结构而实现稳定的共价锚定（但是丙烯酰基化处理之后，玻片会变得疏水不利于后续凝胶均匀覆盖）。 此外，还有一种方案时使用NHS直接添加在凝胶体系中中，这样可以通过共价结合将凝胶于氨基化玻片结合。

第一部分：氨基化玻片制备 目的：使玻璃盖玻片表面带有氨基，为后续与戊二醛交联及凝胶结合提供活性位点。操作需在洁净、无尘环境中完成，避免污染影响硅烷化均一性。建议直接购买氨基化玻片成品使用。

1. 表面羟基化 • 方案1：将25 mm圆形盖玻片平铺于80 ℃热板，中央滴加500 µL 0.1 M NaOH，确保液体覆盖整个表面。 • 方案2：直接使用真空等离子清洗机进行玻璃表面羟基化处理（推荐）。 注意： – 溶液不得沸腾，否则会在玻璃表面形成盐结晶，导致后续硅烷化不均。 – 加热至液体即将蒸干时，应保留一层极薄的半透明NaOH膜；若完全蒸干出现白色颗粒，需立即补加500 µL去离子水并重新80 ℃加热，直至获得均匀薄膜。 – 薄膜不均会直接导致凝胶-玻璃界面结合强度不一致，梯度胶边缘易脱落。
2. 氮气氛围内硅烷化 • 将仍带余温的盖玻片转移至氮气帐篷（或通风橱内快速操作，氧气会消耗 APES）。 • 立即滴加200 µL APES，静置5 min。 • 注意： • – 若无氮气帐篷，在通风橱中操作时需将APES体积增至250 µL，以补偿空气中水分导致的自聚合损失。 • – APES 表面若出现彩虹状油膜，说明已吸水自聚，需延长后续冲洗次数，直至油膜完全消失，否则与戊二醛反应会产生橙色荧光沉淀，干扰免疫荧光成像。
3. 去除游离APES • 先用去离子水缓慢冲淋盖玻片正反面30 s，去除大部分游离APES。 • 将盖玻片置于10 mL去离子水中，摇床轻摇5 min，重复两次。 • 注意： • – 冲洗不彻底会导致游离APES与后续戊二醛交联时产生橙色沉淀，增加背景荧光。 • – 每次换水需用吸头完全吸净旧液，避免残留APES重新吸附。 – 在此步骤后将玻片烘干，并使用抽真空塑封方式可保存数周。
4. 戊二醛交联 • 吸净最后一遍去离子水，加入10 mL 0.5 % (v/v)戊二醛-PBS溶液，室温静置30 min。 • 注意： • – 戊二醛溶液需现用现配，存放超过1 h会自聚，降低交联效率。 • – 若盖玻片表面出现黄色/橙色颗粒，说明APES残留，需返回步骤3重新冲洗。
5. 干燥与存放 • 吸净戊二醛溶液，用Kimwipe轻触边缘吸干，或氮气轻柔吹干。 • 干燥后的氨基-硅烷化盖玻片需在48 h内使用；若制备梯度胶，建议立即进入下一装配步骤，以确保凝胶-玻璃界面结合均一。 • 注意： • – 干燥后避免手指直接接触功能面，可用镊子夹取边缘。 • – 存放超过48 h或暴露于空气中过久，氨基密度会下降，导致凝胶脱落风险增加。 第二部分：氯硅烷化载玻片制备 目的：制备超疏水的玻片便于后续分离水凝胶。建议直接购买硅烷化拨片进行实验。
6. 疏水玻片制备 • 取洁净载玻片，于通风橱内逐张滴加约100 μL DCDMS，并使其完全覆盖整个表面。反应5 min后，用Kimwipe擦去多余DCDMS，再用去离子水冲洗1 min。 第三部分：制备水凝胶 目的：通过自由基聚合将丙烯酰胺与双丙烯酰胺交联成厚度均一、弹性可调的 PA 水凝胶薄膜，并与氨基-硅烷化盖玻片牢固结合，形成“玻璃-凝胶”复合体，用于后续蛋白偶联及细胞接种。
7. 预混液配制 • 按表 10.16.1 目标模量，在1.5 mL离心管中依次加入： • – 40 % (w/v) 丙烯酰胺储液 • – 2 % (w/v) 双丙烯酰胺储液 • – 去离子水或PBS补足至终体积1 mL • 注意： • – 同一硬度批次可一次性配5–10 mL，减少管间误差；预混液4 ℃ 避光可存4周，使用前恢复室温。 • – 若用于细胞培养，建议全程用PBS配制，避免后续渗透压波动导致凝胶膨胀/收缩。
8. 除氧（Degas） • 将预混液置于真空干燥器内，抽真空至液面明显起泡，维持15 min（容器一定要足够大，避免溶液沸腾溢出）。 • 注意： • – 除氧不足会残留溶解氧，淬灭自由基，导致聚合不全、模量偏低；真空度需 ≤ 10 mbar。 • – 除气后静置30 s待气泡完全消失，立即进入下一步，避免氧气重新溶解。
9. 引发剂添加与混匀 • 快速加入1/100体积10 % (w/v) APS与1/1000体积TEMED，立即涡旋 2 s。 • 注意： • – APS与TEMED需室温预温，低温会延缓聚合；加入后超过30 s未使用，聚合即开始，粘度上升，铺胶不均。 • – 涡旋时间不可过长，避免重新引入气泡。
10. 铺胶与压片 • 用100 μL移液器迅速取25 µL聚合液，滴于氯-硅烷化载玻片中央。 规格 体积 14 mm细胞爬片 10 μL 22 mm盖玻片 25 μL 50 mm玻璃片 129 μL 80 mm玻璃片 500 μL

• 立即将氨基-硅烷化盖玻片功能面朝下轻压于液滴上，形成“三明治”结构（图 10.16.1D）。 • 注意： • – 滴加后至盖片压下时间≤ 10 s，避免预聚导致粘度升高、胶层厚度不均。 • – 压片时避免横向滑动，否则会在边缘形成月牙形厚边，影响后续 AFM 模量测定。 • – 若需更厚凝胶，可增至40 µL，但厚度> 200 µm时，底部聚合热难散，易形成梯度，建议降低APS至0.8×。 11. 聚合监控 • 室温静置5–30 min，同时观察剩余混合液：当其完全固化且呈乳白色即为聚合终点。 12. 注意： – 时间过短（< 5 min）会导致未反应单体残留，模量低于表10.16.1预期值；过长（> 40 min）则凝胶脆性增加，剥离易裂。 – 若室温 < 20 ℃，可置于25 ℃恒温板，避免低温延迟聚合。 13. 剥离与冲洗 • 用镊子轻推盖玻片边缘，氯-硅烷化载玻片应自然脱落；若局部粘连，可沿切线方向缓慢揭开。 • 将盖玻片-凝胶复合体放入6孔板，凝胶面朝上，用PBS或去离子水轻洗 2次，每次5 min，去除未聚合单体。 • 注意： – 剥离角度 > 45 ℃易撕裂凝胶；若发现凝胶仍粘载玻片，说明DCDMS疏水层失效，需重新制备载玻片。 – 冲洗水流勿直接冲击凝胶中心，可从侧壁缓慢加入，避免凝胶脱盖。 14. 储存 • 加 2 mL PBS浸没，Parafilm 封口，4 ℃ 可存2周；长期保存请置于PBS + 0.02 % NaN₃，防止污染。 • 注意： – 储存期间若出现凝胶发白、皱缩，提示渗透压不匹配，需立即更换新鲜 PBS。 – 使用前恢复37 ℃，至少30 min，避免温度差异导致AFM模量读数漂移。 第四部分：细胞培养用变刚度基质蛋白底物的制备 目的：将ECM蛋白共价偶联到已制备的PA水凝胶表面，使原本非黏附的凝胶获得支持细胞贴壁、铺展及力学感应的功能化表面，同时保持硬度梯度或定值不变。 15. 凝胶预处理 • 取出盖玻片-凝胶复合体，置于35 mm培养皿，吸去储存液，加入2 mL 无菌PBS轻洗2次，每次5 min。 • 注意： • – 残余NaN₃会淬灭sulfo-SANPAH自由基，必须彻底洗净。 • – 洗涤时保持凝胶面朝上，勿用真空泵直接抽吸凝胶表面，防止物理剥离。 16. sulfo-SANPAH 活化 • 避光条件下，用500 µL 0.2 mg/mL sulfo-SANPAH（溶于去离子水中）完全覆盖凝胶。 • 365 nm UV灯距离3 in（~7.5 cm），照射10 min。 • 注意： • – sulfo-SANPAH见光易分解，操作前才取出暗瓶；照射时确保灯管预热 2 min，能量稳定。 • – 若边缘出现彩虹状油膜，提示sulfo-SANPAH析出，应弃去重新配制；析出会导致蛋白偶联不均。 17. 去除多余交联剂 • 吸走反应液，加入2 mL 50 mM HEPES (pH 8.5) 轻洗3次，每次2 min。 • 注意： • – 残存sulfo-SANPAH会与蛋白非特异性结合，增加背景荧光；最后一次洗涤应完全无色。 18. 蛋白偶联 • 立即加入500 µL ECM 蛋白溶液（推荐0.1 mg/mL Collagen I 或 10 µg/mL Fibronectin/Laminin，溶于50 mM HEPES, pH 8.5），37 ℃过夜（≥ 12 h）。 • 注意： • – 蛋白为限制试剂，浓度决定表面配体密度；过高浓度（> 0.3 mg/mL Collagen）在37 ℃易形成纤维凝胶，出现肉眼白色絮状沉淀，需低速离心后取上清使用。 • – 若使用Collagen I，先在冰上缓慢滴加HEPES至原液，边加边涡旋，避免 pH 跳跃导致蛋白瞬间沉淀。 • – 偶联反应对pH敏感，缓冲液pH必须8.5±0.1；培养皿需密封防止 CO₂酸化。 19. 封闭与终洗 • 吸走蛋白溶液，用2 mL无菌PBS轻洗2次，每次5 min。 • 注意： • – 勿用含氨基酸或蛋白的封闭液（如 BSA），剩余NHS-酯位点会与封闭蛋白结合，降低目标蛋白表面密度。 • – 洗涤后若表面出现网状荧光（荧光显微镜下），提示蛋白聚合层过厚，应缩短偶联时间或降低蛋白浓度。 20. 灭菌与保存 • 加入1 mL PBS，置于生物安全柜中30 min UV灭菌（紫外灯15 W，距离30 cm）。 • 4 ℃ 保存，24 h内使用；长期保存需弃去PBS，加无菌0.02% NaN₃-PBS，4 ℃避光，1周内用完。 • 注意： • – UV 过度照射（> 45 min）会使Collagen I发生交联，导致细胞识别位点丧失，建议控制 30 min。 • – 使用前再以37 ℃ PBS平衡30 min，去除NaN₃并恢复生理温度，避免细胞接种后温度休克。 第五部分：质量控制 • 荧光标记法（推荐）：将未标记与Alexa-488/Cy3标记蛋白按 9:1 混合偶联，共聚焦显微镜下确认表面荧光均匀，中心-边缘强度差 < 10 %。 • ELISA 法：用抗物种HRP二抗显色，测定不同硬度凝胶的吸光度，验证配体密度差异< 5 %。 • 注意： • – 若荧光强度差异>10 %，应返回步骤2重新照射sulfo-SANPAH，再偶联蛋白；切勿直接提高sulfo-SANPAH 浓度，其溶解度有限，易析出。